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项目文章 | lncRNA双重调控促进前列腺癌的发展

 

前言

2020年8月15日,复旦大学肿瘤研究所王建华教授和海军军医大学任善成教授为共同通讯作者,在Cell Death & Disease期刊(IF=6.304)上发表了题为“LINC00675 activates androgen receptor axis signaling pathway to promote castration-resistant prostate cancer progression”的研究论文,首次报道了调控去势抵抗性前列腺癌进展的信号轴LINC00675/MDM2/GATA2/AR。文章中转录组测序及分析由欧易生物完成。

 

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基本信息

英文标题:LINC00675 activates androgen receptor axis signaling pathway to promote castration-resistant prostate cancer progression

中文标题:LINC00675激活雄激素受体轴信号通路促进去势抵抗性前列腺癌进展

发表期刊:Cell Death & Disease

影响因子:IF=6.304

涉及的欧易生物服务产品:转录组测序
 

研究背景

前列腺癌(PCa)是最常见的男性恶性肿瘤,死亡率极高。雄激素剥夺疗法(ADT)是治疗局部晚期、复发或转移性PCa的有效方法。然而,大多数对ADT最初敏感的PCa患者最终发展为致死性的去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。其中,雄激素受体(AR)信号通路失调是前列腺癌发生和发展为CRPC的关键因素。越来越多的证据表明,长非编码RNA(lncRNAs)在癌症的发生和发展中起着重要作用。然而,lncRNAs如何参与PCa进展和治疗耐药的调控机制仍不清楚。因此,阐明PCa发展为CRPC中lncRNA的潜在调控机制,以便开发能够与ADT联合使用的新治疗方法,从而更有效地延长患者寿命。

 

研究内容

本研究中利用转录组测序,鉴定出 LINC00675在雄激素不敏感的PCa细胞系和CRPC患者中上调,并在体外和体内同时验证出LINC00675能够促进了PCa的进展。敲降LINC00675可显著抑制PCa细胞的肿瘤形成,并减弱其对恩杂鲁胺的耐药性。从机制上讲,LINC00675可以直接调节雄激素受体(AR)与MDM2的相互作用,并通过与其结合来阻断AR的泛素化,增强AR蛋白稳定性。此外,LINC00675可与GATA2 mRNA结合并稳定其表达水平,其中GATA2可作为AR信号通路的共激活因子。重要的的是,敲降LINC00675同时联用恩杂鲁胺药物,可有效提高去势抵抗性前列腺癌(CRPC)的治疗效果。研究结果表明,LINC00675/MDM2/GATA2/AR信号轴可作为是CRPC患者治疗的潜在靶点。

 

研究思路

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研究结果

1、LINC00675在CRPC细胞和肿瘤组织中高表达

为了探讨PCa从雄激素依赖到雄激素不依赖的分子机制,作者选用两种雄激素不依赖的细胞系(LNCaP-SF& LNCaP-Abl)和两种雄激素依赖的细胞系(LNCaP-JP& LNCaP)进行转录组测序检测lncRNA表达谱(图1A),发现雄激素不依赖细胞系中有32个lncRNA表达量上调(图1B)。RT-qPCR验证出8个上调的lncRNA(图1C),其中LINC00675沉默后,可显著抑制了肿瘤细胞生长。

序列分析显示,LINC00675位于人类17号染色体上,由两个外显子组成(图1D),且不具备蛋白编码能力。RT-qPCR和FISH实验,证实LINC00675在细胞质中的表达高于细胞核。RNA-scope和RT-qPCR实验结果表明,LINC00675在CRPC患者中的表达高于原发性PCa患者(图1E-G)。并且,基于已有文献的转录测序数据,也发现了类似的结果(图1H)。综上所述,这些结果表明LINC00675的表达与CRPC和PCa的进展相关

 

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图1 PCa细胞和肿瘤组织中LINC00675的表达

 

2、LINC00675促进前列腺癌进展

为了探究LINC00675在PCa发展中的潜在功能,作者构建LINC00675敲降品系(图2A)。与对照相比,降低LINC00675表达后,LNCaP-SF和LNCaP-C4-2b细胞的生存能力降低(图2B),集落形成能力受到抑制(图2C),细胞在S期停止生长(图2D)。细胞迁移实验显示,降低LINC00675表达后,抑制了细胞迁移能力;相反地,过表达LINC00675表达后,促进细胞迁移(图2E)。小鼠皮下异种移植实验结果表明,与对照组相比,敲降LNCaP-C4-2b的LINC00675后,可显著抑制了肿瘤体积和重量的增长。Western blot和免疫组化检测显示,在LINC00675敲降后的肿瘤组织中,AR(雄激素)和Ki67(细胞增生指标)的表达降低。这些结果表明LINC00675可通过调控AR表达进而促进PCa 发展

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图2 LINC00675促进前列腺癌进展

 

 

3、LINC00675通过阻断AR蛋白的泛素化来稳定AR蛋白

基因集富集分析(GSEA)发现,AR信号通路上调。同时,发现LINC00675和AR存在共表达关系,表明LINC00675可能介导AR信号通路。与对照组相比,LNCaP-SF和LNCaPC4-2b细胞中AR蛋白的表达水平升高(图3A),但mRNA水平没有差异(图3C),当LINC00675敲降后,AR的mRNA表达水平不变,但是蛋白水平下降(图3B),表明LINC00675在翻译后水平调控AR,而非mRNA水平。据报道,泛素-蛋白酶体-降解途径是细胞内蛋白质降解的主要途径之一,由此推测AR表达水平可能受到泛素化调控。

为了验证这一可能性,作者首先对LINC00675沉默的细胞进行MG132处理,以抑制蛋白酶体活性,结果发现AR蛋白表达明显恢复(图3D)。然后加入放xian菌酮(CHX)以抑制蛋白合成,观察LINC00675是否影响AR表达。与预期的一样,在LNCaP-SF和LNCaP-C4-2b细胞中,在没有LINC00675的情况下,AR蛋白的降解速度比在有LINC00675的情况下降解更快(图3E)。由此表明,LINC00675基因敲降导致蛋白酶体介导的AR降解,而不是抑制AR蛋白合成。将Flag-AR、His-ubiquitin、LINC00675质粒或siRNA共转染至293T细胞中,进行Co-IP实验。结果显示,过表达LINC00675时,AR蛋白泛素化减弱;而沉默LINC00675时,AR蛋白泛素化增高(图3F)。

对LINC00675敲降的LNCaP-SF细胞和LINC00675过表达的LNCaP细胞分别进行 MG132处理后,进行Co-IP实验。结果发现,在LINC00675敲降后,AR泛素化显著增加,AR蛋白含量降低,而在LINC00675过表达后,AR泛素化受到抑制,总AR蛋白含量升高(图3G)。由此表明,LINC00675通过泛素化的蛋白酶体降解来调节PCa肿瘤细胞中的AR蛋白含量。

 

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图3 LINC00675与AR结合,并阻断AR蛋白的泛素化

 

4、MDM2在AR泛素化中起E3连接酶的作用

据报道,E3泛素连接酶-MDM2可以与AR蛋白的N-末端结构域(NTD)结合,促进AR-泛素相互作用和AR泛素化。当LINC00675敲降后,LNCaP-SF和LNCaP-C4-2b细胞中MDM2的表达水平升高(图4A);相反地,过表达LINC00675后,MDM2的表达水平降低(图4A)。此外,利用siRNA技术沉默MDM2后,发现AR蛋白的表达水平升高(图4B)。由此推测LINC00675可能影响AR与MDM2之间的相互作用,从而抑制AR泛素化。

之后,作者敲降LINC00675之后,同时敲降MDM2。WB结果显示,LINC00675基因被敲降后AR蛋白含量降低,MDM2基因被进一步敲除后AR蛋白含量升高(图4C)。将Flag-AR、HA-MDM2和不同浓度的LINC00675共转染到293T细胞中进行Co-IP实验,发现LINC00675可以抑制AR与MDM2的相互作用,且抑制作用呈剂量依赖性(图4D)。综上所述,LINC00675可以与AR结合,影响AR和MDM2之间的相互作用,从而减少AR泛素化和蛋白质降解。

 

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图4 LINC00675抑制AR与MDM2的相互作用

 

5、LINC00675与AR的互作

为了确定LINC00675与AR具体的结合区域,作者构建了LINC00675的4个不同截断区域(1-488S、1-736S、489-1530S和737-1530S)(图5A)。通过RNA pull down实验和Western blot实验,表明AR蛋白可以与LINC00675的737-1530S区域结合(图5B)。AR的RIP实验结果,进一步证实LINC00675被AR富集(图5C)。之后,作者分别将AR-Flag和截断的AR-Flag质粒,与生物素标记的LINC00675共转染到293T细胞;Westernblot结果证实,LINC00675与AR的NTD结合。之前结果也证实,MDM2也是与AR的NTD结合,由此推测LINC00675与MDM2竞争性结合AR的NTD,导致AR与MDM2分离,从而降低AR泛素化水平,增强AR蛋白稳定性。

为了进一步评估敲降LINC00675后是否可以增强ADT(雄激素阻断治疗)治疗效果,作者对LNCaPC4-2b-ENZ细胞异种移植裸鼠中,分别进行LINC00675 敲降(ASO-LINC00675)+DMSO处理,和LINC00675 敲降+恩杂鲁胺药物(MDV 3100,雄激素受体拮抗剂)处理。与对照组相比,LINC00675敲降联合恩杂鲁胺药物组的肿瘤生长明显受到抑制,且AR和Ki67水平下降(图5E)。

 

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图5 LINC00675与雄激素受体(AR)互作结合

 

6、 LINC00675与GATA2 mRNA相互作用,进而激活AR信号通路

作者首先检测了先前报道过与PCa相关的转录因子(TF)以及与AR存在共同调控的因子,发现GATA2表达量与LINC00675表达量呈正相关(图6A)。据报道,GATA2通过增加AR的结合和活性,在前列腺癌进展中发挥关键作用;且许多lncRNA被报道与mRNA相互作用并增强其稳定性。由此推测LINC00675可能通过与GATA2mRNA结合进而激活AR信号轴来促进前列腺癌发展

利用BLAST,首先鉴定了LINC00675和GATA2mRNA之间的存在高度互补区域。为了验证LINC00675与GATA2的相互作用,作者突变了LINC00675上的结合位点,并将LINC00675-mut和正常的LINC00675转染至肿瘤细胞中,RT-qPCR和westernblot结果均显示,相比正常对照中,LINC00675突变组中,GATA2的表达水平降低(图6B-C)。由此表明LINC00675与GATA2mRNA存在相互作用

为了检测LINC00675是否调节了GATA2 mRNA的稳定性,作者使用α-Amanitin抑制RNA的合成,发现GATA2表达水平降低。过表达LINC00675可延长GATA2 mRNA的半衰期;相反地,敲降LINC00675则缩短了GATA mRNA的半衰期(图6D-G)。AR蛋白的ChIP实验,表明敲降LINC00675后大大降低了AR与PSA启动子和TMPRSS2增强子的结合(图6H)。综上所述,LINC00675通过与GATA2转录本的结合提高了GATA2 mRNA的稳定性
 

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图6 LINC00675与GATA2 mRNA相互作用,激活雄激素受体(AR)信号通路

 

研究结论

本文首次报道了LINC00675通过结合AR蛋白,阻断AR对MDM2的招募作用,防止AR受到泛素系统介导的降解,进而促进去势抵抗性前列腺癌发展。此外,LINC00675可与GATA2 mRNA结合并增强其稳定性,促进AR信号通路激活,因此GATA2可作为AR的共激活剂。该研究揭示了LINC00675/MDM2/GATA2/AR信号轴可作为CRPC治疗的潜在靶点。

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图7 LINC0067/MDM2/GATA2/AR轴信号通路机制示意图

 

参考文献

Yao MF, Shi XL, Li Y, et al. LINC00675 activates androgen receptor axis signaling pathway to promotecastration-resistant prostate cancer progression. Cell Death Dis. 2020,11(8):638.

doi: 10.1038/s41419-020-02856-5.
 

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