行业讯息

单细胞测序技术揭示小鼠皮肤损伤修复过程中成纤维细胞的异质性

前言

皮肤是身体的最外层,主要由表皮和富含胶原蛋白的真皮组成。表皮赋予皮肤屏障功能,真皮提供机械强度的同时会容纳一些表皮附属物,主要是毛囊和汗腺。皮肤受到损伤后的修复过程涉及到毛囊和脂肪细胞的再生。今天为大家带来一篇皮肤损伤相关的单细胞测序文章,该文章通过单细胞测序技术研究伤口成纤维细胞的异质性并进一步探究再生脂肪细胞的来源

欧易生物,基因芯片,生物芯片,基因测序,高通量测序,二代测序,三代测序,酵母文库,生物信息学,转录组,基因组,蛋白质组,甲基化,代谢组学,蛋白检测单细胞测序,核体系酵母文库构建,基因组de novo测序,蛋白质组定量分析,靶向代谢组学, 2b-RAD简化基因组 ,微生物多样性测序

 

基本信息

材料:小鼠损伤皮肤组织,n=12

期刊:Nature Communications

方法:10x Genomics,Fluidigm C1

影响因子:12.121

发表年份:2019年

研究目的:探究小鼠皮肤损伤修复过程中成纤维细胞的异质性以及新生脂肪细胞的髓系来源


研究内容

1. 单细胞分析揭示创伤皮肤细胞的异质性

对损伤2周的皮肤组织进行单细胞测序分析(Fig. 1a),共捕获22,322个细胞,质控后剩余21,819个细胞用于后续分析。降维聚类后共得到13个cluster,通过marker基因鉴定,判断细胞类型包括成纤维细胞、髓系细胞、T细胞、B细胞、雪旺细胞、红细胞、树突细胞和淋巴内皮细胞,其中成纤维细胞涵盖了5个cluster(Fig. 1b),细胞数目约占全部细胞的65%,且这些成纤维细胞都高表达收缩肌成纤维细胞的细胞因子。

欧易生物,基因芯片,生物芯片,基因测序,高通量测序,二代测序,三代测序,酵母文库,生物信息学,转录组,基因组,蛋白质组,甲基化,代谢组学,蛋白检测单细胞测序,核体系酵母文库构建,基因组de novo测序,蛋白质组定量分析,靶向代谢组学, 2b-RAD简化基因组 ,微生物多样性测序

Fig. 1 小鼠皮肤损伤组织单细胞测序分析

 

2. 创伤皮肤中成纤维细胞的异质性分析

将上述成纤维细胞进行二次聚类可得到12个亚群(sC1 ~ sC12)(Fig. 2a-c),对这些亚群的转录因子(TFs)表达模式进行分析,得到20种在所有亚群种均表达的TFs,可将这些TFs定义为常见的创伤成纤维细胞TF特征。

对信号通路标志物,受体及配体等信息进行分析,可将12个cluster分为3个类群:

1. sC3/9/11低表达Pdgfra;

2. sC1/4/5/7/8同时高表达Pdgfra和Crabp1;

3. sC2/6/10/12高表达Pdgfra而低表达Crabp1。

利用免疫荧光染色将这12个成纤维细胞亚群进行空间定位,PDGFRA+/CRABP1+(sC1/4/5/7/8)在表皮下富集,PDGFRA+/CRABP1neg(sC2/6/10/12)主要定位于真皮下方,RGS5+细胞(sC3/9/11)遍布于整个真皮创面(Fig. 2d-j)。

欧易生物,基因芯片,生物芯片,基因测序,高通量测序,二代测序,三代测序,酵母文库,生物信息学,转录组,基因组,蛋白质组,甲基化,代谢组学,蛋白检测单细胞测序,核体系酵母文库构建,基因组de novo测序,蛋白质组定量分析,靶向代谢组学, 2b-RAD简化基因组 ,微生物多样性测序

Fig. 2 成纤维细胞异质性分析

 

3. 探究肌成纤维细胞分化轨迹

虽然t-SNE分析揭示了创伤组织中成纤维细胞的异质性,但它们是否具有共同的分化轨迹还未可知。对上述成纤维细胞的12个亚群进行拟时序分析发现,Pdgfra-(sc3 /9/11)细胞主要占据主轨迹的右半部分,左半部分为Pdgfra+细胞(Fig. 3a)。后续采用RNA velocity分析对细胞的转化方向进行预测,得到3个路径,Path1代表Pdgfra+/Crabp-向Pdgfra+/Crabp+ 细胞的转化,Path2代表Pdgfra-向Pdgfra+/Crabp+细胞的转化;Path3代表Pdgfra-细胞内不同状态之间的转化(Fig. 3b)。表达胶原蛋白基因Col14a1和中胚层特异性转录产物Mest的细胞优先分布在所有路径的起始处(Fig. 3d),表达收缩基因(Acta2 和Tagln)的细胞分布在通路末端。最后使用scEpath算法考察伪时间动力学,鉴定出一些伪时间依赖基因,可分为5个cluster,其中包含了信号分子和转录因子(Fig. 3f-g)。总而言之,拟时序分析、RNA velocity和scEpath分析为探索创伤肌成纤维细胞分化程序的信号转导和转录调节奠定了基础。

欧易生物,基因芯片,生物芯片,基因测序,高通量测序,二代测序,三代测序,酵母文库,生物信息学,转录组,基因组,蛋白质组,甲基化,代谢组学,蛋白检测单细胞测序,核体系酵母文库构建,基因组de novo测序,蛋白质组定量分析,靶向代谢组学, 2b-RAD简化基因组 ,微生物多样性测序

Fig. 3 拟时序分析推测成纤维细胞分化轨迹
 

4. 创伤肌成纤维细胞的造血特性

从成纤维细胞的单细胞测序分析发现,一些成纤维细胞亚群可以表达髓系特异性marker Lyz2,作者分析了共表达髓系marker Lyz2,胶原蛋白基因Col12a1以及肌成纤维细胞收缩性marker(Acta2 和Tagln)的细胞,结果表明,共表达以上marker的肌成纤维细胞约占所有创伤成纤维细胞的11%(Fig. 4a-d)。为了验证这些肌成纤维细胞是否为来自创伤中的髓系细胞,作者对表达Lyz2 的肌成纤维细胞和髓细胞共同进行拟时序分析(Fig. 4e),发现成纤维细胞和髓细胞分布在曲线两端,轨迹中间有一个显著的重叠区(Fig. 4f),这个重叠区的细胞基因表达呈现杂交模式,即同时表达成纤维细胞特异性基因和髓系特异性基因。RNA velocity分析鉴定4条分化路径,其中path 3横跨成纤维细胞和髓细胞的重叠区,可能代表髓细胞向成纤维细胞转化路径,path 4代表损伤髓细胞的分化(Fig. 4j)。RNA velocity与scEpath共同分析表明,cluster rC5中的基因是沿着Path4的髓系分化路径,而cluster rC4和rC3中的基因分别是髓系到成纤维细胞转化途径的早期和晚期。

欧易生物,基因芯片,生物芯片,基因测序,高通量测序,二代测序,三代测序,酵母文库,生物信息学,转录组,基因组,蛋白质组,甲基化,代谢组学,蛋白检测单细胞测序,核体系酵母文库构建,基因组de novo测序,蛋白质组定量分析,靶向代谢组学, 2b-RAD简化基因组 ,微生物多样性测序

Fig. 4 肌成纤维细胞的髓系来源鉴定
 

随后单独分选肌成纤维细胞进行单细胞转录组测序和单细胞Western blot(Fig. 5a),共得到3个cluster(fC1-fC3),其中cluster fC3细胞同时表达髓细胞与肌成纤维细胞的marker(Fig. 5c)。单细胞Western blot检测髓系marker gene lyz2的蛋白表达水平,结果显示,有6%的细胞出现髓细胞和肌成纤维细胞marker gene编码的蛋白共表达现象(Fig. 5e-f),于是采用髓细胞和肌成纤维细胞的marker进行免疫共染(Fig. 5g-h),检测到LYZ/ PDGFRA双阳性细胞。以上结果表明,在损伤修复过程中确实产生了一群带有髓细胞表达特征的肌成纤维细胞。为了验证髓细胞特性的肌成纤维细胞是否存在于已愈合的伤口中,对创伤后12天,15天,21天的单细胞测序结果进行联合分析,共鉴定到4个cluster,其中tC4包含共表达髓细胞与肌成纤维细胞marker的细胞,表明这种具有髓样特征的肌成纤维细胞,持续存在于伤口的修复和再生过程,并可能通过髓样细胞重编程形成。

欧易生物,基因芯片,生物芯片,基因测序,高通量测序,二代测序,三代测序,酵母文库,生物信息学,转录组,基因组,蛋白质组,甲基化,代谢组学,蛋白检测单细胞测序,核体系酵母文库构建,基因组de novo测序,蛋白质组定量分析,靶向代谢组学, 2b-RAD简化基因组 ,微生物多样性测序

Fig. 5 肌成纤维细胞的髓系来源验证
 

5. 造血系细胞有助于伤口真皮的形成

通过上述分析,髓细胞可以在特定情况下转化为肌成纤维细胞,而已有研究表明,在一些损伤过程中,肌成纤维细胞可再生出脂肪细胞。因此作者在骨髓移植(BMT)小鼠模型上进行创伤实验(Fig. 6a),对伤口再生脂肪细胞形成过程中髓细胞的贡献程度进行探究。移植GFP+标记的造血细胞的小鼠,创伤28天后,观察到新生毛囊周围出现许多GFP+细胞,对创伤28天及2个月的伤口组织采用流式进行统计,发现由造血谱系贡献的细胞占比为30%,移植了GFP+标记的非造血细胞的小鼠,在伤口附近未发现GFP+细胞(Fig. 6b-d)。随后采用Sm22-Cre;R26R造血干细胞(HSC)重组的BMT小鼠进行损伤实验,追溯来源于造血细胞的肌成纤维细胞,进一步证实了肌成纤维细胞的造血功能(Fig. 6e-h)。

欧易生物,基因芯片,生物芯片,基因测序,高通量测序,二代测序,三代测序,酵母文库,生物信息学,转录组,基因组,蛋白质组,甲基化,代谢组学,蛋白检测单细胞测序,核体系酵母文库构建,基因组de novo测序,蛋白质组定量分析,靶向代谢组学, 2b-RAD简化基因组 ,微生物多样性测序

Fig. 6 造血谱系有助于BMT小鼠的伤口再生
 

6. 造血细胞系细胞转化为新生脂肪细胞

由于成纤维细胞和脂肪系在发育上是密切相关的,作者推测一些造血细胞系细胞最初转化为肌成纤维细胞,然后转化为新生脂肪细胞。以往的研究表明,骨髓细胞与脂肪组织结合后可以转化为脂肪细胞,因此作者采用脂肪细胞的marker基因Retn作为标记,建立Retn-lacZ HSCs BMT模型,lac Z 基因的表达作为鉴定新生脂肪细胞的髓细胞来源的标志,并证明了髓细胞转化为脂肪细胞是通过直接转化而不是细胞融合。

欧易生物,基因芯片,生物芯片,基因测序,高通量测序,二代测序,三代测序,酵母文库,生物信息学,转录组,基因组,蛋白质组,甲基化,代谢组学,蛋白检测单细胞测序,核体系酵母文库构建,基因组de novo测序,蛋白质组定量分析,靶向代谢组学, 2b-RAD简化基因组 ,微生物多样性测序

Fig.7 BMT模型验证新生脂肪细胞来源于髓细胞
 

7. 谱系研究证实了新生脂肪细胞的髓系起源

通过多种小鼠模型验证造血谱系对新生脂肪的贡献存在于生理过程而不是仅在BMT模型中(Fig. 8a-f),并且在伤口再生过程中髓系细胞的谱系可塑性可能超出了脂肪生成的范围。综上所述,谱系追踪研究明确了髓系细胞在伤口再生过程中可作为脂肪祖细胞的来源之一。

欧易生物,基因芯片,生物芯片,基因测序,高通量测序,二代测序,三代测序,酵母文库,生物信息学,转录组,基因组,蛋白质组,甲基化,代谢组学,蛋白检测单细胞测序,核体系酵母文库构建,基因组de novo测序,蛋白质组定量分析,靶向代谢组学, 2b-RAD简化基因组 ,微生物多样性测序

Fig. 8 髓系细胞有助于形成新生脂肪细胞
 

编者按

总而言之,本研究通过单细胞转录组测序技术揭示了在伤口愈合过程中成纤维细胞的异质性以及髓系细胞强大的创伤可塑性。骨髓细胞和脂肪形成之间的谱系关系表明,探究髓细胞转换为再生脂肪细胞的关键因素对揭示创伤和疤痕的潜在治疗方法有重要意义。
 

参考文献

Guerrero-Juarez C F , Dedhia P H , Jin S , et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds[J]. Nature Communications, 2019, 10(1).

 

END 


 

上一篇:De novo文章不好发?换个思路试一试!下一篇:JHM:转录组测序技术用于评估纳米塑料分子毒理