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PNAS:万向元教授与袁隆平院士团队发现玉米雄性不育基因分子……

前言

2020 年 9 月 9 日,北京科技大学 & 北京中智生物农业国际研究院万向元教授、湖南杂交水稻研究中心袁隆平院士为共同通讯作者,在 PNAS 杂志(IF: 9.412)在线发表了题为“Molecular regulation of ZmMs7 required for maize male fertility and development of a dominant male-sterility system in multiple species”的研究论文,深入研究了玉米雄性不育基因 ZmMs7 的分子调控机制,并基于 ZmMs7 创制了不同植物通用的显性雄性不育技术体系。

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北京科技大学安学丽、马彪、董振营与湖南农业大学段美娟为共同第一作者,文章中酵母文库实验由欧易生物完成。

 

研究背景

玉米是杂种优势利用最为成功的作物之一。目前,玉米杂交制种主要通过人工或机械去雄,费时费力且成本高昂,因此雄性不育系是玉米杂交制种的关键技术。基于细胞质不育的三系法在玉米杂交制种中也有应用,但由于不育系是细胞质遗传的,存在遗传资源有限、育性不稳定等问题。因此,采用生物技术手段以利用雄性不育基因开发新的雄性不育体系,成为当前研究的重点,比如万向元教授团队之前所建立的玉米多控不育(MCS)系统。

ZmMs7 是一个编码 PHD-finger 的转录因子,是玉米花药发育中的关键调控因子,但其精细的分子调控机制仍待进一步研究。

 

研究内容

本研究报道了玉米雄性不育基因 ZmMs7 的分子调控机制,及其在多物种显性雄性不育系统中的应用。ZmMs7 在玉米花药中特异性表达,它可以作为转录激活因子在绒毡层发育和花粉外壁形成中起到关键调控作用。ZmMs7 可以与玉米核因子 NF-Y 亚基相互作用,形成 ZmMs7-NF-YA6-YB2-YC9/12/15 蛋白复合物,通过直接结合启动子区的 CCAAT box 激活靶基因。ZmMs7 在玉米中由花药特异性启动子 p5126 过表达会导致显性和完全雄性不育,但营养生长和雌性育性正常;进一步利用 p5126-ZmMs7 基因元件,成功构建了一个在玉米、水稻和拟南芥中通用型的显性不育(DMS)技术体系。此外,ms7-6007 隐性雄性不育系和 p5126-ZmMs7 显性雄性不育系在不同遗传种质下都具有很高的遗传稳定性,可用于玉米杂交育种。本研究为花药和花粉发育的分子机制提供了新见解,并为作物杂交育种提供了一种有潜力的新技术。

 

研究结果

1. ZmMs7 基因是玉米绒毡层发育和花粉壁形成所必需的

ZmMs7 基因敲除系均表现为与 ms-6007 突变体类似的完全雄性不育(下图 A),这表明 ZmMs7 基因是玉米雄性育性所必需的。在玉米花药发育的不同阶段分别进行电镜观察(下图 B-D),结果显示 ZmMs7 功能的丧失会导致绒毡层退化延迟、Ubisch 体发育异常和花粉壁形成,这些发育缺陷最终导致完全雄性不育。

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图片说明:A) ZmMs7 基因敲除系的表型;B) 花药半薄切片分析;C) 扫描电镜观察花粉粒发育;D) 透射电镜观察花粉壁形成

 

2. ZmMs7 作为转录激活因子调控玉米绒毡层发育和花粉壁形成

RT-PCR 显示 ZmMs7 在花药发育的四分体和游离单倍体小孢子期特异性表达(下图 A)。双荧光素酶报告系统证实 ZmMs7 具有转录激活活性(下图 C)。利用转录抑制结构域 SRDX 融合抑制 ZmMs7 转录,可以显著抑制玉米的花药和花粉发育,导致完全雄性不育(下图 D)。

 

RNA-seq 测序显示,野生型 WT 与 ms7-6007 之间存在 1143 个差异表达基因,其中包括一系列与绒毡层和花粉壁发育相关的基因、脂代谢相关基因等。GC-MS 检测显示ms7-6007 花药中总角质含量、角质单体含量显著减少(下图 F)。表明 ms7-6007 突变阻碍了角质的生物合成,改变蜡和内部脂肪酸的成分,从而影响了花药壁发育和花粉壁形成。

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图片说明:A) 再花药发育不同阶段进行 RT-PCR 检测 ZmMs7 表达量;B) ZmMs7 亚细胞定位;C) 双荧光素酶报告细胞检测 ZmMs7 的转录激活活性;D) 利用 SRDX 抑制 ZmMs7转录的玉米表型观察;E) wt 与 ms7-6007 的差异表达基因;F) G) wt 与 ms7-6007 的花药角质、蜡质、脂肪酸含量比较

 

3. ZmMs7 与 ZmNF-Y 亚基形成多蛋白复合物

ZmMs7 本身不具有 DNA 结合结构域,为了研究 ZmMs7 如何调控下游靶基因,利用酵母双杂交文库进行了互作蛋白筛选,结果显示 4 个 NF-Y 蛋白(NF-YA6、NF-YC9/12/15)可以与 ZmMs7 结合,并且互作关系可以通过 Co-IP、Bi-FC 得以证实。并且酵母双杂交、Co-IP、Bi-FC 显示 NF-YA6 可以与三个 NF-YC 亚基 NF-YC9/12/15 互作。酵母双杂交文库筛选并经 Co-IP、Bi-FC 证实,18 个 NF-YBs 可以与 NF-YC9/12/15 互作,但不与 NF-YA6 或 ZmMs7 互作。RT-PCR 显示,NF-YA6、NF-YB2、NF-YC9/12/15 在花药发育的第 6-10 阶段均存在表达。以上结果表明,ZmMs7 可以与 NF-YA6、NF-YB2、NF-YC9/12/15 形成蛋白复合物。

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图片说明:A) 酵母双杂交和 Co-IP 实验检测 ZmMs7 与 NF-YA6、NF-YC9/12/15 的互作关系;B) 酵母双杂交和 Co-IP 实验检测 NF-YA6 与 NF-YC9/12/15 的互作关系;C) 酵母双杂交和 Co-IP 实验检测 NF-YB2 与 ZmMs7、NF-YA6、NF-YC9/12/15 的互作关系;D) BiFC 实验检测 NF-YB2、ZmMs7、NF-YA6、NF-YC9/12/15 间的互作关系

 

4. ZmMs7-NF-Y 复合物直接激活靶基因的表达

对上述 RNA-seq 筛选到的差异表达基因进行验证,转录激活实验显示 ZmMT2C 启动子可以被 ZmMs7-NF-Y 复合物激活。EMSA 实验显示 MBP-NF-YA6 可以特异性结合到ZmMT2C 启动子中的 CCAAT box motif。ChIP-qPCR 也表明 ZmMs7 可以在体内结合到 ZmMT2C 启动子。

 

ZmMT2C 的同源基因 OsMT2b 在水稻中参与花药绒毡层的细胞程序性死亡。TUNEL 实验表明在 ms7-6007 突变体花药中绒毡层细胞的程序性死亡得以延迟,透射电镜分析也显示绒毡层的退化延缓。以上结果表明,ZmMs7 蛋白复合物可以通过靶向调节 ZmMT2C的表达调控绒毡层细胞程序性死亡。

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图片说明:A) 双荧光素酶报告系统检测 ZmMs7-NF-Y 复合物对 ZmMT2C 启动子的激活;B) EMSA 检测 ZmMs7 与 ZmMT2C 启动子中 CCAAT box 的结合能力;C) ChIP-qPCR 检测 ZmMT2C 启动子的富集程度;D) TUNEL 检测野生型和 ms7-6007 突变体中 DNA 断裂情况;E) 透射电镜观察绒毡层退化;F) ZmMs7-NF-YA/YB/YC 复合物通过直接激活ZmMT2C 表达控制雄性不育的模式图

 

5. 花药特异性启动子 p5126 驱动的 ZmMs7 提前表达导致玉米显性雄性不育

过表达 ZmMs7 的同源基因,在拟南芥和大麦中可以导致显性雄性不育。为了在玉米中建立显性雄性不育系统,构建了一个 p5126-ZmMs7M 载体。转入了 p5126-ZmMs7M载体的玉米表现出显性雄性不育性,但其营养生长和雌性育性正常(下图 A)。显微观察显示,表达 p5126-ZmMs7M 破坏了花药绒毡层和花粉壁的发育(下图 C-F)。

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图片说明:A) – C) pull down 检测 CO 与 TOE1 的结合;D) – I) 双荧光互补实验检测 CO 与 TOE1 的结合;J) Co-IP 检测 CO 与 TOE1 的结合;K) – L) semi-in vivo pull-down 检测 CO 与 TOE1 的结合。

 

6. ZmMs7 的提前表达改变了玉米绒毡层和花粉发育相关基因的表达模式

与野生型对比,转录组测序发现 126 个基因在 p5126-ZmMs7M 转基因植株中上调、在ms7-6007 突变株中下调(下图 A),功能富集分析显示这些基因对于花药、绒毡层和花粉壁发育至关重要。RT-PCR 显示,在 p5126-ZmMs7M 转基因植株中,雄性不育相关基因均发生不同程度的提前表达(下图 C)。

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7. ms7-6007 突变遗传稳定,适用于杂交玉米育种和制种

403 个玉米自交系材料为母本,分别利用 ZmMs7/ms7-6007 杂合子进行授粉,选择杂交 F1 代中的 ZmMs7/ms7-6007 杂合个体再进行自交产生 403 个 F2 家系。对 F2 家系进行表型统计,其中 376 个家系中可育/不育植株符合 3:1 分离比,27 个家系偏离 3:1。并且利用 ms7-6007 特征性 marker 证实雄性不育性状的偏离在这 27 个家系中是稳定的。

 

同时,利用 31 个优质品系为父本,分别与 ZmMs7/ ZmMs7、ms7-6007/ms7-6007纯合子杂交,对分别种植于 3 个地点的 F1 子代进行 17 个农艺性状的统计,结果显示所有杂交组合后代表型均大大优于它们各自的亲本。以上结果表明,ZmMs7 基因及其突变体ms7-6007 适用于玉米杂交育种和制种。

 

将 p5126-ZmMs7M 转基因植株与 392 个品系杂交,利用与 p5126-ZmMs7 偶联的mCherry 荧光信号作为筛选标记,结果显示 392 个 F1 中正常颜色种子(即不含有p5126-ZmMs7 质粒)的植株都是雄性可育的,带有荧光的种子(即不含有 p5126-ZmMs7 质粒)均表现为雄性不育。以上表明 p5126-ZmMs7M 诱导的显性雄性不育相对稳定。

 

8. 玉米、水稻和拟南芥显性雄性不育系统构建

将 p5126-ZmMs7M 质粒转入水稻,水稻表现出正常的营养生长,但花药较小、缺乏有活力的花粉。将 p5126-ZmMs7M 质粒转入拟南芥,拟南芥花药呈褐色、几乎没有花粉粒形成,没有萌发能力。以上结果表明,利用 ZmMs7 表达系统,可以在单子叶植物(玉米和水稻)与双子叶植物(拟南芥)中构建通用型的显性不育(DMS)体系。

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研究结论

本研究针对玉米雄性不育基因 ZmMs7 开展了深入探究:ZmMs7 可以与 NF-YA6、NF-YB2、NF-YC9/12/15 形成蛋白复合物,共同参与对靶基因 ZmMT2C 转录的直接激活作用,进而调控玉米绒毡层发育和花粉壁形成。本研究构建了 p5126-ZmMs7M 表达载体,该表达系统可以在玉米、水稻、拟南芥中稳定表达,用于构建完全显性雄性不育系。同时,在玉米不同遗传种质背景下杂交实验表明,ms7-6007 隐性雄性不育系和 p5126-ZmMs7 显性雄性不育系都具有较高的遗传稳定性。同时与 p5126-ZmMs7 偶联的 mCherry 荧光信号可用于进行转基因种子的方便挑选。本研究为花药和花粉发育的分子机制提供了新见解,并为作物杂交育种提供了一种有潜力的新技术。
 

参考文献

X An, B Ma, M Duan et al. Molecular regulation of ZmMs7 required for maize male fertility and development of a dominant male-sterility system in multiple species.PNAS 2020; doi: 10.1073/pnas.2010255117.
 

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