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CUT&Tag技术用于棉花染色质H3Kme3修饰研究

自2019年CUT&Tag技术被报道以来,见刊的文章都是将该技术用于动物细胞或者组织的研究,鲜少有用于植物样本的数据,本文介绍的是发表于2020年8月份的一篇将CUT&Tag技术用于植物细胞核样本的案例。该案例将ChIP-seq和CUT&Tag做了对比,通过数据比较展示了CUT&Tag技术用于植物样本的优势。

CUT&Tag技术用于棉花染色质H3Kme3修饰研究

 

材料及方法

1. 植物材料:异源四倍体棉花四周龄幼苗的根、叶片和20天棉铃的纤维样本。

 

2. Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5转座酶(诺唯赞)

注:抗体与pG-Tn5/pA-Tn5的亲和性需要确认。通常,pA和pG具有广泛的抗体亲和特性,然而,pA与兔源抗体具有更高的亲和性而pG与鼠源抗体具有更高的亲和性。

 

3. 抗体:

1) H3Kme3(Millipore cat. no. 07-473, 1mg/ml),该抗体为兔多克隆抗体,用于研究组蛋白第三亚基四号赖氨酸的三甲基化修饰。

2) 兔IgG(Millipore cat. no. 12-370,1mg/ml),作为 CUT&Tag实验的对照抗体。
 

研究结果

1. CUT&Tag和ChIP-seq的流程对比图

CUT&Tag技术用于棉花染色质H3Kme3修饰研究

图1

 

从图1 可知,CUT&Tag在操作上比ChIP-seq要简便许多:

1)CUT&Tag采用原位策略,不需要使用交联来稳定蛋白-蛋白和蛋白-DNA之间的相互作用。交联样本由于使用甲醛而导致后续用20%的Triton进行细胞核分离存在困难。

2)在CUT&Tag实验中,使用完整的细胞核和抗体共孵育,细胞核使用洋地黄皂苷在核膜上打孔利于抗体的进入,但是不破坏核的完整性。

3)ChIP-seq实验中,染色质从分离的细胞核中提取出来之后要进行超声破碎,将DNA打断成300-500bp的小片段,此过程耗时较长,在免疫共沉淀之后,如果不解交联,DNA很难抽提出来;

4)最后,ChIP得到的DNA进行建库比CUT&Tag多耗时4-5个小时。

 

2. CUT&Tag使用的细胞核可以通过DNA测定进行半定量


植物细胞存在细胞壁,抗体很难进入细胞,作为替代方案,可以使用细胞核作为起始材料进行实验。对于CUT&Tag实验所需的细胞核进行显微镜观测定量是比较困难的,因为分离的细胞核容易聚集成团,本文通过抽提的DNA来对所投入的细胞核进行了定量,结果表明,大约1.5μg的DNA就可以满足CUT&Tag实验的要求。1g根和4g纤维大致相当于15-20μg的染色质,可以满足约10次CUT&Tag实验。

CUT&Tag技术用于棉花染色质H3Kme3修饰研究

图2

 

3. CUT&Tag生物学重复显示高重复性及高信噪比


实验设计了2个生物学重复,IgG抗体作为CUT&Tag实验对照;同样的实验材料也进行了ChIP-seq实验,ChIP mock反应不加H3Kme3抗体作为对照。

结果显示:CUT&Tag-IgG对照显示了低背景信号,两个生物学重复的CUT&Tag实验建库成功,峰型符合预期(图3)。

CUT&Tag技术用于棉花染色质H3Kme3修饰研究

图3

 

对所有文库进行测序后,数据比对结果见表1,CUT&Tag文库最后得到的数据10.61、15.3和14.16M,而ChIP-seq得到的数据是23.17和31.34M。

 

表1

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对数据进行相关性分析表明:CUT&Tag的两个生物学重复和CUT&Tag_IgG的相关性很低,只有0.01(图4a),表明CUT&Tag实验组和对照组差异明显;对ChIP-seq的对照和实验组进行相关性分析结果显示,二者的相关性为0.89(图4a),说明两组数据的信噪比较差。对CUT&Tag实验组的两个生物学重复进行相关性分析结果表明二者的相关性为97%,说明生物学重复较好(图4b)。

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图4

对各个样本分别随机抽取6-24M数据进行分析,结果如表2所示:在抽取同样数据量的情况下,CUT&Tag鉴定到的peak数量更多,CUT&Tag在6M数据量时鉴定到的peak数量为42367个和46779个,而ChIP-seq在数据量达到24M时鉴定到的peak数量为40859个。这说明CUT&Tag的灵敏度更高。表2括号中的数字为FRiP(fraction of reads in peaks),CUT&Tag的FRiP为0.66-0.7,说明CUT&Tag实验结果具有很高的信噪比;而ChIP-seq的FRiP仅为0.11,说明其信噪比较低。

表2

CUT&Tag技术用于棉花染色质H3Kme3修饰研究

对两种方法所得peak进行分析发现25,597 (54.7–62.6%) peaks 为 CUT&Tag 和 ChIP-seq共有, 37,168 (79.5–87.7%) peaks 是CUT&Tag两个生物学重复共有的,这说明了CUT&Tag的生物学重复非常稳定(图5)。

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图5

 

将所得的peaks分为8类:1–2 kb 启动子 (1–2 kb 5′ upstream of translation starting site);1-kb 启动子(≤ 1-kb 5′ upstream of translation starting site);第一外显子,第一内含子, 其它外显子, 其它内含子, 1-kb 下游 (≤ 1-kb 3′ upstream of translation terminating site)和基因间区(除以上所描述区域),结果发现,两种实验方法所得结果高度一致(图6)。

CUT&Tag技术用于棉花染色质H3Kme3修饰研究

图6
 

研究结论

综上所述,利用植物细胞核进行CUT&Tag实验研究表观基因组学具有实验流程简单,有效数据留存率高,信噪比高,结果准确的优势。

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