三代全长转录组测序

 
 
三代全长转录组测序(PacBio三代测序)
 
SMRT测序的全称是Single Molecule, Real-Time Sequencing
即单分子实时测序,是PacBio推出的一项专利技术
 
顾名思义,SMRT技术核心就是能够实现单个DNA分子的测序
并且实时监控测序结果
 
 

 

 

技术流程
 
文库构建流程
PacBio Sequel系统使用的全长转录组建库有SMARTer®和SuperScript®两种方式
经过对仪器和试剂的调试,欧易使用效率更高的Clontech公司的SMARTer® PCR cDNA Synthesis Kit进行建库
 
相比前代RS系列测序仪,Sequel系统在SMRT Cell片段长度偏好性方面已经有很大改进
4 kb以下的建库无需进行片段大小选
SMARTer®文库构建示意图
 
 
分析流程
Sequel数据分析流程示意图
 
 

 

 
 
数据分析内容
 
Iso-seq分析包含4个主要的步骤,分别是CCS,Classify,Cluster和Subset(可选)
Iso-seq分析示意图
 
CCS步骤:该步骤主要基于来自同一条Polymerase Read中的Subreads序列构建CCS序列。
Classify步骤:该步骤通过分析CCS序列,输出两个文件。一个文件包含全长非嵌合体序列(Full-length Non-chimeric Reads)和非全长序列。
在该过程中,Classify步骤会去除CCS序列中包含的PolyA/T Tails和Primer序列,去除污染序列,但是会保留PCR引起的嵌合体序列。
Cluster步骤:该步骤基于全长非嵌合体序列和非全长序列,进行质量校正处理,生成Polished高质量的一致性序列和低质量一致性序列。
Subset步骤:这是一个可选步骤,主要用于从输出文件中将指定类型的序列输出出来,比如非嵌合体Reads等。
 
 
根据测序样本对应参考基因组的有无,会有分析内容上的差异
如果进行三代全长转录组测序的同一批样本有二代转录组测序的数据(或同时进行二代转录组测序)
则可以将二、三代转录组测序的数据结合进行分析,增加表达差异信息
 
欧易公司最近对分析流程进行升级,无参全长转录组测序也能够进行可变剪接分析
 
 

 

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